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科研大神說,Western Blot是研究僧的勞斯萊斯...-北京博奧森生物技術有限公司
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科研大神說,Western Blot是研究僧的勞斯萊斯...
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2020-5-22

 
 生物屆有一句名言——Western Blot是研究僧的勞斯萊斯。

Western Blot蛋白印跡)雖然是科學研究中最為基礎平常的實驗,其背景里卻蘊含了很多知識,操作過程中也有許多trick,可以說“好的WB結果是順利畢業的一半”。
 

1.蛋白樣品制備——千萬別garbage in,garbage out

A: 蛋白提取:裂解要快速徹底,先變性后保存,在不影響后續實驗的情況下盡量選擇較強的裂解液 (RIPA裂解液);蛋白提取要在低溫條件下進行,防止蛋白自溶或降解,同時可以加入適當的蛋白酶抑制劑以減少蛋白酶的水解作用。磷酸化蛋白提取還需加入蛋白磷酸酶抑制劑,以防止蛋白去磷酸化。

B: 蛋白定量:確定合適的上樣量,最常用的為BCA法 (BCA蛋白定量試劑盒)。


2.電泳SDS-PAGE——合適即完美

A: 制備上樣樣品:根據實驗要求,選擇變性/非變性上樣緩沖液,上樣前可以適當離心。

B: 配制聚丙烯酰胺凝膠:根據蛋白分子量的大小選擇合適的膠濃度,蛋白分子量小應選擇高濃度的膠,蛋白分子量大則選擇低濃度的膠;TEMED和APS促進凝膠反應,一般先加TEMED,后加APS;常溫下半小時膠可凝固,若天氣寒冷或需加快凝固,可將其置于37℃孵箱中加速凝固;膠最好現配現用,如果需要短暫保存,要用濕潤的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。

C: 配制電泳緩沖液:內槽電泳緩沖液要現配現用。

D: 根據蛋白分子量選擇合適的預染Marker

E: 濃縮膠電壓一般采用100V左右,待溴酚藍遷移出濃縮膠后再換為200V。

3.轉膜——小手抖一抖,條帶變沒有


A: 膠在負極,膜靠近正極;為防止短路,濾紙不要大過膜【“三明治夾心”如圖示】,夾好膜和凝膠后,確保凝膠、膜和濾紙之間無氣泡,否則會導致轉膜不完全。

B: 轉膜緩沖液要提前冷卻,且膠要在轉膜緩沖液里平衡一下,防止膠變形,同時有助于去除影響轉膜的雜質;轉膜全程帶手套操作,避免手印污染影響結果;膜上可以剪一個小角用來標記正反面。

C: 濕轉法轉膜的電流一般在200-400mA之間,轉膜時間為30-60分鐘,也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據蛋白的分子量大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的轉膜時間越長,分子量越小則需要的轉膜時間越短。

D: 可使用麗春紅染色液初步檢測轉膜效率,它與下游WB檢測完全兼容,無任何干擾。染色后可以用蒸餾水,PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜硝酸纖維素膜 (NC膜)和醋酸纖維素膜上蛋白的檢測,不適用于尼龍膜上的蛋白檢測。


4.免疫印跡——接下來就是見證奇跡的時刻

A: 常見的封閉液有5%脫脂奶粉BSA封閉液,磷酸化蛋白使用BSA作為封閉液, 脫脂奶粉會對磷酸化蛋白檢測有影響。

B: 封閉時間和封閉液劑量要足夠,封閉不充分顯色背景會過深;洗膜時間要適當,一般用TBST洗滌5min×3次,過度洗膜會使信號減弱;抗體的稀釋倍數按照產品說明書和實驗要求進行適當調整,抗體濃度不宜過高。

C: 顯色:一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法,A、B發光液按比例稀釋混合,現配現用。不同蛋白最佳曝光時間不同,如果同一張膜上不同樣品信號差異太大,可以嘗試將膜剪開再分別進行曝光。

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蛋白免疫印跡(WB)實驗流程及配套試劑


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