掃碼關注公眾號           掃碼咨詢技術支持
客服熱線:400-901-9800  客服QQ:4009019800  技術答疑  技術支持  質量反饋  人才招聘  關于我們  聯系我們
新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗原檢測法的優勢-北京博奧森生物技術有限公司
首頁 > 促銷活動 > 正文
新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗原檢測法的優勢
發表者:北京博奧森生物      發表時間:2020-4-15

以下文章來源于小桔燈網 ,作者SMACs

小桔燈網


目錄

? 前言


? 新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)臨床診斷中RT-PCR方法的假陰性問題


?RT-PCR方法對檢測設備或平臺要求較高


?核酸檢測耗時較長


?急需快速準確診斷COVID-19的方法


?COVID-19臨床診斷中抗體檢測法假陽性的原因


?新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗原檢測法的優勢


?SARS-COV-2抗原快速檢測試劑盒簡介


?COVID-19抗原法快速診斷的優勢


前言

2019年底,中國武漢發現了新冠綜合癥(COVID-19),其病原體最早由中國科學家鑒定為一種不同于以往的新型冠狀病毒,并第一時間向全球發布了其全基因序列,病毒最初定名為2019-nCoV。


由于其序列及感染癥狀與2003年引起SARS爆發的冠狀病毒相似,世界病毒學會將其定名為SARS-COV-2。現在,該病毒已經引起世界范圍COVID-19大規模流行,目前已有累計超過40萬人被確診,死亡人數超過1萬8千人,這一數字仍在快速增長。


COVID-19癥狀表現

面對來勢洶洶的傳染病的大規模流行,大量人群需要被篩查、確診并做相應的處理,臨床對診斷試劑的需求極為迫切。除口罩、防護服等醫療用品外,在武漢疫情早期以及現在的意大利、西班牙等國都出現了檢測試劑的巨大缺口。


對于病原體的檢測,PCR(聚合酶鏈式反應)方法是可以最早被應用的方法。制備病毒核酸特異性引物序列相對較快,核酸檢測的理論特異性和靈敏度都很高,因此基于PCR方法的病毒核酸檢測試劑盒成為此次針對新冠病毒檢測最早被開發的試劑盒。


在中國的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中,實時熒光RT-PCR陽性被作為新冠病毒感染的確診證據之一。然而,在實際診斷過程中,核酸法卻暴露出很多問題:

  • 假陰性問題;

  • 設備或檢測平臺要求較高;

  • 時間較長;

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)臨床診斷中RT-PCR方法的假陰性問題


首先,假陰性意味著漏檢,不僅會導致臨床中對疑似患者不能快速確診,而且會使漏檢者成為潛在的病毒傳染源。

其次,據報道,甚至出現了多次核酸檢測陰性而出院的患者又再次復發的情況,也很可能屬于假陰性引起的誤診。

理論上核酸檢測法特異性和靈敏度都是比較高的,低含量的病毒仍可以被檢測到。造成“假陰性”這一問題可能與多種因素有關,大致分為采樣問題、試劑盒問題及陽性標準問題這樣幾個方面。


  1. 采樣問題:


    1.1  呼吸道標本:

    由于新冠肺炎最常見感染肺及下呼吸道(還包括其它組織感染),因此樣本中病毒載量肺泡灌洗液>痰>咽拭子,當使用咽拭子采樣時,病毒載量可能較低,檢測結果取決于所用試劑盒的最低檢測限;

    1.2 取樣操作標準化:取樣位置、力度等需要標準化;

    1.3  樣本制備及保存:

    首先,臨床樣本一般采集量有限,這對核酸提取存在挑戰。其次,樣本中可能存在多種復雜成分影響核酸的提取。而如果核酸提取純度低,將影響下游的PCR反應,因此當病毒總量低時,容易造成假陰性結果;

    由于呼吸和飲食都通過咽部,咽部存在大量微生物,樣本采集過程中會不可避免混入核酸酶。核酸酶穩定性很高,一般的滅菌等清除或抑制試劑很難完全消除酶活性,它會造成樣本中核酸被降解,核酸檢測缺乏模板,因而檢測結果為陰性;


  2. 試劑盒問題:

    2.1 試劑盒本身設計造成的靈敏度問題:

    由于核酸檢測試劑盒設計時需要在特異性和靈敏度之間平衡,比如使用多重PCR可以提高特異性,但多對引物之間的相互干擾可能會造成靈敏度降低。但如果不使用多重PCR,則一旦所選則的靶位點核酸序列產生突變,就會造成試劑盒失效。因而檢測陰性可能與試劑盒的設計有關;

    2.2 由于疫情發展嚴重,大量試劑廠商在搶時間生產,這可能造成試劑之間的精準度有差別。


  3. 陽性標準問題:

    陽性病例需要經過綜合判斷,之所以稱為“假陰”通常是通過臨床癥狀等確認為陽性。但臨床癥狀可能與病程發展有關,病程初期及經過抗病毒治療后,病毒載量可能較低,造成核酸檢測陰性。

RT-PCR方法對檢測設備或平臺要求較高

在采樣后,核酸檢測還包括核酸提取和PCR擴增兩個步驟,所采用的試劑盒和設備包括核酸提取試劑盒、熒光探針、以及熒光RT-PCR儀等。高靈敏度的RT-PCR儀價格不菲。

另外,為避免空氣中各種微生物可能帶有的核酸酶的影響,核酸檢測對實驗室的潔凈度要求也較高。

最后,核酸檢測是一項精密的實驗,對操作人員的要求也較高,需要經過專門的操作培訓。這使得在大規模疫情爆發時,各大醫院具有核酸檢測資質的實驗室很快被飽和,大量樣本堆積無法及時獲得檢測。



核酸檢測耗時較長

完成一個RT-PCR的檢測通常需要4-6個小時,然而考慮到樣本運輸、大量樣本積壓的情況,通常最快24小時才可以報告結果。

據報道,在湖北,將樣本送到實驗室要花幾個小時,而結果的發布要花幾天時間。當地衛生部門表示,這些實驗室每天可以進行6千個檢測,但是工作人員全天候工作,也沒有足夠的實驗室能夠應付這樣的工作量。


急需快速準確診斷COVID-19的方法

由于核酸檢測在診斷中所暴露出的問題,除CT等臨床癥狀指標外,臨床醫生急需一種能夠快速診斷COVID-19的方法,能夠實現對人群的大規模篩查。

《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中,將病人血清學指標,針對新冠病毒的特異性抗體IgMIgG陽性,作為診斷標準之一,該方法被稱為抗體檢測法。

抗體檢測法基于人體對于外源病原體的免疫反應。當感染病原體后,人通常在7-10天在血清中出現針對該免疫原的特異性抗體IgM,它們是機體抗感染的“先頭部隊”。如果血清中檢出病原體特異性IgM,提示新近發生感染,可用于感染的早期診斷。通常在20天后,可以檢測到針對病原體的特異性IgG


(人體在病原刺激后的體液免疫反應曲線)

然而在實際診斷過程中,抗體檢測法卻暴露出多種問題,不能單獨作為診斷指標用于篩查,只能作為當核酸檢測為陰性時的輔助診斷方法。

FDASARS-COV-2檢測指導中明確指出,抗體檢測不能單獨用于新冠病毒診斷,不能排除感染或說明感染狀態。有其它病毒如HKU1、NL63、OC43229E等的既往或現時感染時抗體檢測也可能呈陽性。


FDA新冠病毒檢測指導(Issued on the web on March 16, 2020.)


COVID-19臨床診斷中抗體檢測法假陽性的原因

首先,假陽性診斷將使得未感染的人被送至隔離點,有可能造成感染,其密切接觸者被隔離,也造成社會資源的浪費。

SARS-COV-2(或2019-nCoV)特異IgMIgG抗體檢測出現假陽性的原因是什么?根據國家臨床檢驗中心的分析,主要是由于陽性判斷值的設定、樣本的內源和外源干擾物質造成。但從根本上講,是由于大部分抗體檢測試劑盒在方法學上的固有缺陷造成的。

1、  陽性判斷值的設定

每種檢測試劑盒在研發時,都需要通過對大量陰性和陽性樣本的檢測,得出檢測結果分布圖,如下圖所示。陰性和陽性樣本的檢測值往往會有一定交疊,這意味著一部分弱陽性結果實際上為假陽性。因此,需要設定合理的陽性判斷值,以減少假陽性的產生;



2、 樣本中的干擾物質

2.1   內源性干擾

內源性干擾物質一般包括類風濕因子、嗜異性抗體、補體、因使用鼠抗體治療或診斷誘導的抗鼠Ig抗體等。在日常的臨床血清(漿)樣本中,有相當比例的樣本不同程度的含有上述各種干擾物質,從而可能導致測定結果的假陽性。

2.2 外源性干擾

外源性干擾物質包括樣本溶血、樣本被細菌污染、貯存時間過長和凝固不全等。

3、采樣時間窗問題

由于機體體液免疫發生的時間因人而異,采樣時待檢人員血清中病毒特異性IgM或IgG的水平可能處于不同的階段,會造成檢測假陰或假陽性問題。

4、方法學缺陷

大部分抗體檢測試劑盒采用捕獲法ELISA原理實現對特異性抗體的檢測。即通過抗IgM/IgG的抗體,捕獲樣本中的IgMIgG。如果是病原體特異性的IgMIgG,它將結合帶有標記的抗原,從而在試紙條的檢測線或96孔板的相應孔中顯現出來。

由于捕獲抗體(抗IgM/IgG抗體)會結合血清中的任何IgMIgG,因此該方法的特異性僅基于一對抗原-抗體的特異性識別和結合(即血清中的抗體識別試劑盒所提供的病毒蛋白)。這造成了在復雜的樣本成分中,由于非特異性結合而引起的假陽性

捕獲法ELISA原理圖


新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗原檢測法的優勢

抗體識別和結合抗原上的某個表位(或抗原決定簇),如果這個表位序列與其它非靶點蛋白的某段序列或表位相似,則可能造成抗體與非靶點蛋白結合,這稱為交叉反應(Cross-reactivity)。交叉反應是免疫反應普遍存在的一種現象。

交叉反應

如果使用兩種抗原特異性抗體去識別和結合一個靶點抗原的不同表位,則可以大大降低這種交叉反應的幾率。簡單的數學描述就是,假設一個抗體與非特異靶點的交叉反應幾率為1/100,當使用兩種不同表位抗體識別時,這個幾率將降為1/10000。兩種抗體檢測一種抗原的檢測方法被稱為雙抗夾心法,抗原檢測試劑盒多采用這種方法。


雙抗夾心法ELISA原理圖


SARS-COV-2抗原快速檢測試劑盒簡介

依據雙抗夾心ELISA原理,通過免疫層析技術制備的新冠病毒抗原快速檢測試劑盒核心組成如下圖所示,樣本滴加在樣本墊上,通過液相層析依次通過結合墊,NC膜上的檢測線(T線)和質控線(C線)。


抗原快速檢測試紙條示意圖

結合墊內含有標記的抗原特異性抗體,可以與樣本中的抗原(病毒蛋白)發生結合,當液流到達檢測線(T線)時,固定在這條線上的第二種抗原特異性抗體再次與抗原結合,將會呈現陽性結果。質控線(C線)包被IgG抗體,可以結合樣本墊中抗體,用于判斷層析過程是否順利。


抗原檢測試劑盒反應原理


下圖分別顯示陽性、陰性和測試失敗的情況。如果質控線(C線)未顯色,則測試失敗,需要重新檢測。

抗原檢測試劑盒結果判斷


COVID-19抗原法快速診斷的優勢

為滿足快速診斷的需求,利用免疫層析技術開發的快速檢測試劑盒具有很多優點:

  • 快速:

    檢測一個樣本僅需10-15分鐘,可以做到現場快檢。RT-PCR方法需要4-6小時才能得到檢測結果,且由于設備等原因,不能做到現場快檢。

  • 操作簡便,無需特殊設備和人員培訓:

    RT-PCR方法檢測需要熒光定量PCR儀。

  • 特異性高:

    雙抗夾心法保證了抗體交叉反應低,從而有效提高了免疫學方法的特異性,減少假陽性的發生。

  • 靈敏度穩定:

    理論上,由于核酸檢測可以將病毒模板擴增,其靈敏度高于免疫學檢測方法。但在實際臨床使用中,由于前述對樣本制備的要求較高,造成核酸法診斷假陰性較高。而免疫學方法對樣本的要求相對較低,抗原蛋白較穩定,因而抗原檢測試劑盒靈敏度表現穩定。


    新型冠狀病毒綜合癥(COVID-19)實驗室診斷方法比較:

總之,新型冠狀病毒(SARS-COV-2)抗原檢測法可有效減少RT-PCR法的假陰性和抗體檢測法的假陽性問題,診斷快速、準確、對設備和人員要求低,其特點適合大規模新冠病毒感染疑似病例的快速排查,對疫情集中暴發的快速排查非常有效。也可以作為出院病例核酸檢測的再次確診方法,避免假陰性患者出院造成新的傳播風險。(注:用于臨床需用有證產品)

SARS-CoV-2研究產品推薦

SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleoprotein ELISA Kit



SARS-CoV-2 重組N蛋白

產品編號 bs-41408P
英文名稱 Recombinant SARS-CoV-2 N Protein (His tag)
序列 Recombinant SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein (full length) (His tag)
分子量 46kDa
純度 ≥90%

SARS-CoV-2 重組N蛋白抗體

英文名稱
產品編號
克隆類型

Anti-SARS-CoV-2N

protein

antibody

bs-41408R

Rabbit 

pAb

bsm-41411M

Mouse 

mAb


SARS CoV 相關產品

重組蛋白產品

英文名稱
產品編號

Recombinant SARS N protein

bs-49002P

Recombinant SARS-CoV-2 

protein-C

bs-41409P

Recombinant SARS-CoV-2 

Spike Protein S1

bs-41405P
Recombinant SARS-CoV-2 Spike Protein RBD bs-41407P
抗體產品
英文名稱
產品編號
克隆類型

Anti-SARS spike 

glycoprotein S1

antibody

bs-17239R

Rabbit 

pAb

Anti-SARS 

S-protein antibody

bs-0130R

Anti-SARS putative 

orflab polyprotein 

antibody

bs-0132R

Anti-SARS N 

antibody

bsm-49131M

Mouse 

mAb

bsm-49132M

bsm-49133M

bsm-49134M

bsm-49135M

ACE2 抗體產品

英文名稱
產品編號
克隆類型

Anti-ACE2


bs-1004R

Rabbit pAb

bs-23027R

bs-23028R

bs-23443R

bs-23444R

bsm-52614R

Rabbit mAb

即將上線產品

產品類別
英文名稱
產品編號
克隆類型
抗體 Anti-SARS-CoV-2 Spike Protein S bs-24382R

Rabbit 

pAb

bs-24383R
bs-24384R
重組蛋白

SARS-CoV-2 Spike Protein S2

bs-41406P

--




版權所有 2019-2022 www.ldj3n9.com 北京博奧森生物技術有限公司
通過國際質量管理體系ISO9001:2008 GB/T19001-2008認證    編號:00115Q211807R1M/1100
京ICP備05066980號-1         京公網安備110107000727號
奶牛视频app官方下载_奶牛视频app下载i_奶牛视频app无限次数